W roku 1774 podczas eksperymentów w południowej Anglii uzyskał niezwykły gaz, który sprawiał, że świeca paliła się w nim żywym płomieniem. Dwie uncje (60 ml) tego gazu wpuścił do słoika, w którym wcześniej umieścił mysz. Żyła ona dwa razy dłużej niż mysz w słoiku wypełnionym zwykłym powietrzem. Priestley sam zaczął oddychać tym gazem i powiedział, że „przez jakiś czas miał szczególne uczucie lekkości i rześkości”.

Okazało się, że odkrył tlena. Określił go jednak mianem odflogistonowanego powietrza, zakładając, że jest to zwykłe powietrze pozbawione flogistonu — hipotetycznej substancji, która podobno miała hamować spalanie. Chociaż wniosek Priestleya był błędny, wielu nadal uznaje to odkrycie za jego kluczowe osiągnięcie.